中药现代技术研究的缘起与流行及反思 - 威灵仙

TUhjnbcbe - 2021/1/19 1:51:00

中药现代技术研究的缘起与流行及反思

俞仲毅,余国姗

(上海中医药大学科技实验中心上海)

现代中药研究基本上是沿用先寻找先导化合物?再提取其有效成分?最后开发新药这一研究模式?化学成分和药理作用的研究也随着西方医药学理论和研究方法影响的深入,更加成为现代中药学研究的重点内容?但传统的中药理论被严重忽视或淡化,得出的研究结果与传统中药理论关联度低,与中医的临床用药思路不合拍,值得我们反思和改进?为了在研究中保持中药特色,使中药的现代研究与更高层次上传统中药理论实现统一,笔者就中药现代技术研究的缘起以及中药鉴定?中药药效物质基础研究的发展做简要概述,并进一步对其中存在的问题进行分析探讨?

1中药现代技术研究的缘起

1.1西方医学的影响

早在唐朝就有西方传教士在华从事行医活动,至康熙年间传教士在中国的医学活动已非常频繁?晚清鸦片战争后国门大开,医院?学校?报刊等团体的不断发展使西医学在中国的传播不断扩大和深入,对中医药提出了尖锐的挑战,一时间中西之争沸沸扬扬?中医界的有识之士客观地分析了中西医学的利弊之处,如方以智就提出了西学“详于质测而拙于言通几”的看法,指出了中医区别于西医的独特优势在于中医强调人与事物的有机统一,而西医却忽视了事物的整体性?一些西方传教士虽不认同中医,但对中药持以肯定态度?如英国传教士雒维廉医生就肯定了中医仔细探寻病因,然后根据经验对症下药进而治愈疾病的方法,这无疑对中药现代研究有着积极的影响?相关研究人员出于西方医学具体化?单一化?精确化的思维范式,对中医药物质基础提出了识别和验证的要求?

1.2现代技术研究的端倪

年,日本学者长井长义从麻*中分得左旋麻*碱(ephdrine);年,德国E.Merck制药厂从当归中提制流浸膏“优美露”(Eumenoi),之后国内相继制造当归制剂“健美露”(Jimenol)?“当归丸”(Jancol)等?民国时期,单味中药的科学分析即已成为国内中医研究的主要内容之一,其中著名的就有麻*和当归有效物质的提取,如被誉为中国药理学研究先驱的陈克恢教授于年发表了关于麻*碱药理作用的第一篇论文?至此,中药现代技术研究初露端倪?

近代中药科学分析模式在中药的品种来源鉴定?化学成分?药理作用等方面的运用正是中药现代技术研究的开端,并在此基础上进行了深入探索?生药学专家赵橘*曾指出:“药材之科学研究,鉴定为至难之第一问题也?”中药鉴定是中药科学研究最难也是首要应解决的问题,之后才能进行药物化学及药理学的研究,而中药现代技术研究大致也可从中药鉴定与药效物质基础研究两方面展开?

2中药鉴定的研究现状

中药具有成分复杂?质量不稳定?难以定性定量分析和有效成分不确定等特点?传统的人工中药鉴定方法虽然简捷?快速,但是存在着较大的主观性和经验性?中药鉴定研究的目的是发现一套客观的?准确的鉴别中药品种的方法?随着生物科学技术的不断发展,有效地推动了我国中药鉴定技术的开展,在基源?性状?理化?计算机辅助鉴定等方面有了长足的进展?

2.1基源鉴别

基源鉴定是运用植(动?矿)物的分类学知识,考察中药真实性,确定其学名,以此保证应用品种的准确?现代发展起来的基于蛋白质?免疫特异性?DNA和RNA等遗传物质的鉴别可归属于基源鉴别?

蛋白质电泳鉴别是应用电泳区分不同中药蛋白质分子大小?形状或所带电荷来鉴别中药的方法,而蛋白飞行时间质谱是利用飞行时间质谱分析中药所含肽和蛋白质种类及组成来鉴别中药材的一种鉴定技术?抗血清鉴别技术是采用免疫学测定方法测定中药含有的抗原性物质来鉴别中药的一种方法;同工酶电泳与蛋白质电泳的操作过程及分离原理基本一致,如张袖丽等对滴水珠?半夏等的同功酶进行了研究,发现酯酶(EST)和苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶是鉴定半夏属药用植物宜选的酶系统?有研究者认为生物效应鉴定技术是从药效的角度对中药进行客观评价的最好方法,但其实验方法专属性强?通用性差;免疫分析法适用于动物药材的鉴别,尤其适用于分辨亲缘较近的动物药材?

DNA和RNA等遗传物质的鉴定是运用比较多的方法?在DNA水平上最早用于中药鉴定的是限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术,但与同工酶标记一样,RFLP不适用于鉴别干燥中药材;随机扩增多态性DNA(RAPD)技术已应用于厚朴?苦地胆?木蓝属等的鉴别研究,是目前常用的DNA特征图谱法;马小*等采用扩增片段长度多态性分析(AFLP)技术对5个人参农家类型进行了比较研究,找到了其DNA特征指纹差异?AFLP产生的多态性比RFLP多,也不需要了解DNA模板序列,且它的可重复性比RAPD高?随机和简单限定引物的PCR标记技术,目前主要用于生物遗传关系和多样性分析,如蒋超等运用PCR技术快速鉴别了蛤蚧及其常见伪品?PCR标记技术通用性差,较难满足良好的鉴定要求;基于分子杂交的DNA分子技术第一次用于北沙参基原植物珊瑚菜(GlehniaLittorals)?不同居群的鉴别,之后柴胡等药材或其基原植物的鉴别也用到了此法?因该技术对DNA量和质的要求都较高,所以推广应用有一定难度?DNA条形码技术由加拿大分类学家PaulHebert于年首次提出,郑安勇等用DNA条形码技术有效地鉴别了威灵仙及其混伪品,蔡炫等也用此技术对市售花胶进行了准确的基原鉴定?DNA条形码鉴定技术是传统生物鉴定方法的有效补充,目前已成为物种鉴定和分类的研究热点;借助mRNA差异显示技术可以将种植与野生的植物药材及地道与普通药材之间的差异鉴别出来?染色分类鉴别技术在常用中药材鉴定中的研究已经比较普遍,如*柏?*芪?牛蒡子等,且该方法所需的硬件条件要求简单,但目前缺乏通用的数据库?

2.2性状鉴别

性状鉴别可分为传统性状鉴定和在此基础上发展起来的比较现代的性状鉴定方法?传统性状鉴定方法尤其适用于不能借助仪器和其他鉴别手段的野外?如江彬等创立了紫花地丁及其习用品的简单适用的性状鉴别方法,能够正确鉴别紫花地丁及其习用品;华高明?张玉芹等运用性状鉴别方法顺利完成对川芎?红花等中药材及中药饮片与其伪品的鉴别,虽然此种方法具有快速?简便?无损的优点,但需鉴定者具有一定的理论基础和丰富的实践经验,因此推广难度较大?

后来发展的性状鉴别方法有性状显微?偏光显微镜?扫描电镜?仿生识别等,但显微鉴别在区别基本结构非常相似的亲缘关系较近的物种或药材时有一定难度?如吴林菁等发现鲜品酢浆草可用其横切面显微特征进行区分,但将酢浆草粉末显微特征作为鉴别依据值得商榷?偏光显微镜不仅是鉴定矿物药的重要手段,而且植物类中药材组织细胞内含物如淀粉粒?结晶体?石细胞等的色彩在偏光显微镜下的变化是特异稳定的?如吴莹等用扫描电镜对中药饮片浙贝母的真伪进行鉴别比较,得出对于中药材的鉴别,表明使用扫描电镜可快速?有效地鉴别出仅通过简单观察而难以辨别优劣和真伪的饮片?

仿生技术是利用电子设备模仿人的各个感官,并根据一定的模式识别算法识别药物的一种方法?如电子鼻可根据指纹(标记)图利用一定的模式识别算法来识别不同的气味成分;电子舌将感受到的化学物质通过传感器阵列中像舌面上味蕾一样的每个独立的传感器给出各个物质的感官信息,最后进行区分辨识?电子舌具有高灵敏性?可靠性?重复性,同时还可对一些成分含量进行测定?

2.3理化鉴别

传统理化鉴别常用于性状相似?显微特征不明显?化学成分不同的药材,但传统鉴别在指标性成分鉴别方面具有局限性?近几十年来,中药理化鉴定方法随着色谱?光谱技术在中药领域的广泛使用而不断发展,光谱?色谱技术也成为中药现代鉴定技术的主要发展方向?

薄层色谱法(TLC)能提供直观的可见光或荧光图像,且操作简单?快速?经济;而HPLC是目前使用最多的中药特征图谱测定方法,其分离?鉴别能力远远高于TLC?HPLC色谱稳定性?重现性好,但鉴定每种中药都需特定的固定相?流动相和检测方法的特定组合,通用性较差?气相色谱法(GC)主要是根据不同化合物在固定相和气体流动相之间的分配不同进行分离分析的手段;与HPLC比较,高速逆流色谱(HSCCC)的分离度和重复性并无多大变化,操作更简便?更易掌握,但HSCCC的理论体系尚未完善,目前应用较少?

高效毛细管电泳法(HPCE)鉴定技术是凝胶电泳技术的进步,适合分离有机酸?生物碱等带电荷物,且大分子?小分子成分都可用HPCE进行分离?HPCE也可用于动物类药材的鉴别,但HPCE方法的稳定性和重复性较色谱差?

光谱技术也比较成熟,是应用最为广泛的鉴别技术?如周容等用红外光谱技术对人参产地进行了区分;马丹等用红外光谱对唐古特大*及其不同炮制品进行鉴别,找出了它们化学成分含量及种类的不同?当前,该技术已成功运用近红外光谱技术对人参?冬虫夏草?灵芝以及丹参等药材产地进行分析鉴别?郭萍等还用傅里叶变换红外(FTIR)光谱和拉曼(FT-Raman)光谱直接?快速?无损地鉴别了绞股蓝;朱世玮等采用傅里叶变换拉曼光谱鉴别出了肉桂及其混淆品(阴香?胶桂?土肉桂?山桂?月桂等)?X-射线衍射在年首次运用于中药材的鉴定,之后运用于多种动植物及矿物药的鉴定研究中,鉴定效果最好的是矿物类中药,但是衍射法仍然难以分辨成分和晶型相同或差异极少的药材?秦海林等还使用核磁共振氢谱鉴别了天麻?*连等药材,陈艳江等使用太赫兹光谱和支持向量机方法鉴别了南北柴胡?炙甘草和生甘草?山豆根和北豆根,但这些方法因受到仪器?成本等方面的限制,难以推广普及?

质谱法(MS)具有不受试样物态限制?信息直观等优点,且灵敏度及准确度高?指纹特征性强,常与HPLC?GC等技术联用,其中应用最广泛的是HPLCMS?HPLC-MS联用技术,将HPLC与MS的优点结合起来,定性中药样本中的未知化学成分,初步确定其化学结构,可对中药质量进行比较全面的评价?如董静等采用高效液相色谱/电喷雾-离子阱-飞行时间质谱(HPLC/ES-IT-TOFMS)对蒽醌类以及羟基二苯乙烯类对照品进行了分析,总结了其多级裂解规律?联用技术遵循“从整体到部分,先定性后定量”的原则,以指纹图谱的整体鉴别为主,以成分的定性定量检测为辅,这可能是中药特征图谱未来研究发展的主要方向?

2.4计算机辅助鉴定

20世纪70年代后期,连续切片的计算机三维重建技术迅速发展起来?计算机运算速度快?存储量大?以图形方式显示和输出重建结果的优点促进了植物组织切片的研究?

模式识别法是化学计量学的一个重要分支?如苏薇薇等用TLC?HPLC?UV?IR?聚类分析等方法结合计算机技术的模式识别法成功对10个不同产地的5种*芩?78个苦丁茶样品?中药细辛进行了鉴定;皮胜玲等采用指纹图谱与模式识别相结合的方法对28批不同产地的野生和栽培药材进行测定,表明可以作为质量控制和评价的有效手段之一?

聚类分析技术是将数据信息结果进行分析归类统计,并进行公式化处理,最后对中药材进行动态聚类分析的一种技术?郭怀忠等证明了聚类分析辅助中药寡糖电泳分析在3个科属的6种中药如*精?玉竹鉴定上的有效性?

热分析法是在程序控制温度下,测量物质的物理性质与温度关系的一类技术,包括差热分析法(DTA)?差示扫描量热法(DSC)?热重分析法(TG)几种,而DTA在中药材鉴定中用得最多?然热分析法以矿物药材最为理想,可与红外光谱法?气相色谱法等方法联用获得大量可靠而广泛的信息?

毋容置疑,中药的鉴定是以传统鉴定法为基础,逐步发展现代科学鉴定方法来适应中药现代化,并建立了更为科学?完善?先进的中药鉴定体系,借此让中药走向世界?

3中药药效物质基础研究现状

中药物质基础的研究经一个多世纪的努力,不同程度载有药理作用的已有千余种,研究较为深入的近百种?上海有机化学研究所数据库收载的与中药相关的化学成分种,《中华本草》记载的与中药有关的药理作用百余种?可见,中药的多组分?多靶点和整体调节的优势和特色决定了中药的复杂性,对其机制的研究和质量控制也提出了严峻的挑战?有研究认为,能产生直接或间接药效的“有效成分群”组成了中药及其复方的临床疗效?药理作用的物质基础,而不是单一的“有效成分”,因此笔者认为中药药效物质基础研究可分为药物化学成分的研究和进一步的药效作用的研究?

3.1中药化学成分研究

药物化学成分研究的方法有拆方研究法?整方研究法?系统分离法?系统生物学技术?分子生物色谱技术与多靶点筛选技术等?拆方研究是近十余年中药复方研究中最为常用的一种方法,有不少文献报道通过该方法可发现具有代表性的有效成分,但拆方研究仍有很多不足,它打破了中药复方的整体性,忽视了方药合煎的影响以及各成分之间的相互作用?如麻杏石甘汤,该方有辛凉宣泄?清肺平喘的功效,而单味药均不具有抑菌或杀菌作用;茵陈蒿汤可清热?利湿?退*,而单味药也没有保胆保肝的作用?整方研究法弥补了拆方法的一些不足,常用于复方的研究,而且拆方法与整方法的结合使用,既可克服拆方法的局限性,也简化了整方法中复杂的化学成分,更能系统全面地阐释中药物质基础,更好地体现中药(复方)的整体性?

系统分离方法结合药效学实验研究是较早运用的方法之一,其采用不同的色谱模式与联用技术对中药组分进行分离与表征,能最大程度地从不同角度对中药物质基础进行阐述?中药组分系统表征方法深入解析中药全成分?指导中药组分的系统分离?制备的优点弥补了常规色谱分离方法不能有效分离强极性化合物的不足,在中药物质基础研究中起到了至关重要的作用?但要注意的是中药系统中各化学成分的不可缺少性和不可分离性,否则将不能保证中药及复方原有的功用和主治,也就失去了研究意义?

细胞膜色谱法是将药物在体内的作用过程在体外进行动态模拟,将分离和活性筛选紧密结合起来,解决了以往成分分离和活性筛选脱节的问题?然而高通量药物筛选工作在我国起步较晚?且不规范,随着生物芯片技术的发展,多靶点高通量筛选技术在中药有效成分的发现?分离中发挥着越来越重要的作用?系统生物学技术主要研究生物系统中所有成分的组成,如基因?mRNA?蛋白质以及在一定条件下这些成分之间的关系,该技术在很大程度上符合中药整体性的特点,为探究中药及复方中药物质基础提供了可能的有力武器?

3.2中药药效作用研究

中药药效作用的最初研究方法是以中药或其化学成分对整体动物或对离体器官组织活细胞的研究为主,与西药单一成分的研究方法基本一致?以后逐渐发展出分子中药血清药理学与血清药物化学研究法?中药组学技术?代谢组学研究?中药有效组分联合谱效关系研究法等?

血清药理学?血清药物化学是日本学者田代真一在19世纪80年代提出的新概念?血清药理学是给动物灌服中药一定时间后取其血清进行实验的药理学研究方法,为快速?准确地研究确定中药复方药效物质的有效途径之一?但整体各组织细胞之间没有协同反应是血清药理学的主要缺陷,而血清药物化学解决了药物吸收入血前的相互作用问题,但还是缺少整体对药物反应的鉴别手段?

马增春等提出了“分子中药组学”的概念,其关键技术是化学组学?基因组学和蛋白质组学,并与李鹰飞等用分子中药组学方法研究发现了四物汤补血作用的分子机制是影响造血相关细胞因子的表达?

谱效关系研究法通过将有效组分指纹图谱与药效结果联系起来,建立谱效关系,探讨复方的物质基础?“谱”通常指指纹图谱或特征图谱,中药指纹图谱的建立包括色谱图获取和相似度评价两部分,获取方法主要为HPLC或UPLC及其联用技术?谱效关系研究虽然能够直观地判断出色谱峰相应成分对药效的作用,但却忽略了多种成分的共同作用,缺乏系统性?

代谢组学是近年来的研究热点,如冯年平等用代谢研究法发现大鼠服用小柴胡汤后血浆中出现了原方中没有的一些新化合物?代谢研究法可更快速地发现有效成分,在研究机体正常状态-疾病-中药这个有机系统时体现出了一定的优势,但是代谢组学技术准确性不足?定性过程复杂?难以实现全部组分的定量分析,这在一定程度上限制了它的广泛应用?

事实上,中药药效物质基础研究中的中药化学成分和药理药效的研究并没有明确的界限,两者通常都有交叉,且互相影响?比如中药在煎煮过程中的成分变化对药效产生的不可忽视的影响:姜霞等给大鼠灌胃银翘散发现产生的新代谢产物可能是发挥药效的物质;甘洪全等对健康志愿者口服冠心Ⅱ号煎剂后进行血清中药物化学成分检测,发现中药各种药效成分之间可以相互影响它们的吸收入血过程,进而对中药整体的药效产生影响?可见,中药也可能是间接发挥作用,如有效成分入血转运后使机体应激产生了新的激素?递质等生理活性物质,而脱离机体整体后单独成分不表现出相应的药效作用?所以中药药效不等于其已知化学成分的作用,中药药效作用也不等于已知化学成分对个别组织细胞的作用?

4中药现代技术研究存在的问题

中医辨证和遣方用药都遵循整体性原则,但是中药的研究却是大多脱离了中医药整体观?通常都是对个别化学成分?某种化学组分或单味药进行研究,尽管取得了不俗的成绩,但药物的整体性和作用的整体性在研究中几乎丧失殆尽,所以中药研究存在的问题主要是整体性问题?

4.1中药鉴定研究存在的问题

现代科学技术鉴定中药大多是药物成分的鉴定研究,更多的是将一味完整中药进行分割解剖,目的是使中药鉴定更加精细化?精确化?标准化?高速化?信息化,希望逐步引导中药鉴定与国际药学测定接轨,但是却忽略了中药的整体性,忽略了植物遗传的多态性和成分的多态性与植物整体性状稳定性之间的区别与联系,割裂了中药所含成分与“性能”等中医药理论的内在联系,也切断了完整中药与丰富的临床实践经验的联系?这样的研究仅仅更利于新药的研发,实际上无法用以指导中医的临床实践?张明发等对辛温(热)合归脾胃经药在利胆?抗溃疡和抗炎方面的作用进行了研究,结果显示了性味与归经结合对药效的重要影响;杨霖等应用数据挖掘进行了中药性味归经的关联分析,结果显示出中药性?味?归经等药性属性之间的正性或负性的交互作用?目前《药典》上主要还是运用整体性状来鉴定中药品种,仅利用显微鉴别和理化鉴别进一步保证用药的质量,说明大多数学者切实认识到研究完整中药的重要性?

4.2中药药效物质基础研究存在的问题

随着中药现代技术研究的深入,遭遇到中药多成分?多靶点作用的复杂性?如何解决复杂性基础上的可测性问题以及物质基础与中医药理论联系问题,是中医药现代化研究的瓶颈,制约着中药现代化研究的发展,使得符合中医特色的中药物质基础研究进展缓慢?如何有效获取中药的强极性成分?微量元素和表征信息是中药基础研究中的另一个重大技术问题?传统的中药物质基础研究主要有两种模式:一种是将所有化学成分的总和作为研究目标,此模式保留了中药的特点,但对具体功效成分不清楚;另一种方法是将单一化合物从中药中分离出来,将发现的新的化合物作为研究的目标,这种模式不能从中药的特色———整体协同作用机制上进行深入的认识?此外,当前主流模仿化学药物“活性导向分离/高通量筛选”的中药活性成分的发现模式,将中药整体逐渐分解为单一成分,且以同一成分的含量测定值对具有不同功能主治的中药进行质量控制,缺乏具体中药的专属性,割裂了成分间的有机关联,也割裂了机体整体有序结构之间的有机联系,难以体现中药的作用特点,甚至有可能出现化学成分越分越细?药理活性与中药临床实践渐行渐远的状况?

许多中药植物药与矿物药甚至动物药具有近似的药物性能,如果单从药物的成分入手,相同药性很难找到相同的化学成分?因此,可能只有从中药整体引起机体整体的反应中才能找到中药植物药?矿物药?动物药具有相同的药物性能的依据?同样,如果缺少机体整体性,也很难解释不同中药引起机体(对相同性能)相同反应的机制?尽管中药药效物质基础的研究还存在诸多问题,但必须遵循系统性?普适性和高效性三个原则已获得共识?从中药物质基础研究方法上的突破,发展新的药效物质基础研究模式来促进中药物质基础研究的快速发展,系统全面地阐明中药药效物质基础,可以加速对中药物质基础的全面认识?

5中药现代技术研究需遵循的原则及愿景

保持中药特色是中药研究的一个关键问题?很多学者认为中医药理论的整体观与系统生物学的整体观高度相似,因而提出尝试运用其先进的技术方法解决中医药研究的瓶颈问题的研究思路?但是系统生物学与中医药理论整体观并不完全相同,两种整体观在系统性质?系统结构?元素构成等方面都具有明显的差别?例如:中医药整体观主要由理论性要素构成,系统结构交叉渗透,强调物质本源一致性;系统生物学则主要由实体性元素构成,系统结构一线贯通?层次分明,强调生物物质发生的因果递进关系?深入探讨两种整体观的差异和联系,可以为突破中医药研究的瓶颈提供研究思路和方法?除此之外,代谢组学在中药复方中的研究也能够体现传统医药的整体生物效应,是促进传统医药和现代医药达到有效融合的重要手段之一,将成为中医药研究的重要工具?

近代中药研究最大的变化是,研究重心从传统的经验积累?整体观等哲学思辨作为中医药理论的顶层设计向下层的中药科学研究转移?尽管无论是中药鉴定还是中药药效物质基础研究都离不开现代科学技术的引入,但是现代系统论认为整体大于组成部分的简单相加?因此,在科学技术的引入过程中,应该时刻保持清醒的认识?保持中医药理论与已知物质世界的联系,才能使中医药的物质基础研究不会偏离更高层次的顶层设计———整体观的轨道,这一点在中医药的物质基础研究过程中无疑显得尤为重要?

笔者的课题组利用14C-脱氧葡萄糖整体放射自显影等方法,探寻中药性味归经作用部位的形态结构基础,结果表明中药性味归经有其形态学基础,中药性味归经的作用与多个解剖学脏器有关,中药药性具有“泛组织”性质,即每种药性都有整体性含义?但中药“四性”“五味”作用之间以及与“归经”等作用是可以区分的,区别的要点是每种药性引起全身各器官组织反应的方向?幅度等模式的不同?因此,通过建立中药药性理论?中医脏腑概念与解剖学器官组织的联系,从理论技术层面去阐明中药的“药有个性之特长,方有合群之妙用”是十分有利且必要的?充分考虑整体的研究方法,对于呈现中药复杂性?获得国际认可?突破中药研究现状应该是一个主要解决方案?中药的现代研究如何能与更高层次上传统中药理论实现统一,是我们面临的亟需解决的问题?只有符合中医药自身发展规律?体现中医药特色?充分发挥中医整体观念和辨证论治的长处,才能避免现代医学注重局部和靶点施治的短处,中医药的研究才能可持续发展?相信在每个医药工作者的不断探索之下,中医药的现代技术研究会不断地带给我们甚至全世界惊喜?