甲氧沙林液 http://pf.39.net/bdfyy/bdfyc/170224/5231253.htmlKeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince
概述
OVERVIEW
Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine(IF=1.)刊载了一篇由吉林大学药学院药理学系徐华丽博士(Email
hljlu.edu.cn)团队发表的名为LaxativeEffectsofYangyinTongmiCapsuleonaModelofDiphenoxylate-InducedConstipationinMice(DOI:10.//;Published22February)的文章。该文章研究的结果表明，养阴通秘胶囊（YTC）通过调节肠激素和神经递质的含量以及调节结肠中相关蛋白的表达，对地芬诺酯诱导的便秘具有缓解作用。
前言TNTRODUCTION
便秘是临床上常见的消化系统疾病，其特征表现为长期持续的排便困难和完全排便，这严重影响了大多数患者的生活质量，也给人们带来了不同程度的负担和精神负担。便秘不仅会导致胃肠功能紊乱，还会导致心脑血管疾病和肝性脑病。近年来，随着社会治疗的发展，人们的传统生活方式也发生了变化。流行病学调查表明，发病率呈上升趋势。目前，便秘的病因和发病机制主要包括肠道神经递质和胃肠肽的变化、结肠功能障碍和Cajal间质细胞异常，便秘可能是上述因素的结果。肠道神经系统对研究便秘的发病机制具有重要意义。肠神经系统有一个相对独立的结构，它包含许多神经节和神经纤维，它们相互交叉形成网状沟来控制胃肠功能。胃肠道产生多种胃肠激素，包括以SP、Ach、MTL为代表的兴奋性递质和以NO、GT、SST等为代表的抑制性递质。水通道蛋白在消化系统中表达并发挥生理作用，它们的分布与其功能有关。在人类基因组中，AQP3和AQP8主要表达在粘液表皮细胞中，这表明了它们的重要作用。此外，还有许多关于ICC的研究。ICC是胃肠道的起搏器，它具有产生和传递慢波、调节神经递质等功能。这是调节胃肠运动的重要部分，也是控制胃肠平滑肌在胃肠系统中运动的中间媒介，ICC参与胃肠神经递质的信号转导和神经递质的调节。研究表明，肠内ICC的结构、形态或数量的变化可能是便秘的必要机制。SCF/C-kit信号通路可以影响ICC的表型和功能。由于ICC表型的可逆性，它为便秘的治疗提供了重要的靶点。YTC由肉苁蓉、黑芝麻、当归、杏仁、桃仁、威灵仙、玄参、郁李仁、枳壳组成。然而，还没有关于YTC在便秘发展中的作用及其相关机制的报道。因此，目前的研究旨在探讨YTC对地芬诺酯诱导的便秘的影响。
方法METHOD
1.实验设计40只昆明小鼠(20±2g)在受控的环境条件下(25℃和12小时的光/暗循环)，将动物关在正常的笼子里，并允许自由地获得标准颗粒饲料和水。将小鼠随机分为以下研究组:正常对照组用双蒸水(20ml/kg)处理；模型组用地芬诺酯(10mg/kg)处理；低剂量YTC组(L-YTC)用地芬诺酯(10mg/kg)和0.6g/kgYTC处理；高剂量YTC组(H-YTC)用地芬诺酯(10mg/kg)和1.2g/kgYTC治疗。使用地芬诺酯(每片0.mg阿托品和2.5mg地芬诺酯)诱导小鼠便秘，连续给药14天，每天一次。在第15-28天在L-YTC和H-YTC组每天给药YTC一次。所有药物均通过灌胃给药。2.粪便参数测量在最后一天给药后，每组小鼠给予10%木炭，并分别置于代谢笼中6h。记录了第一次粪便的排泄时间和6h内粪便的重量。然后，粪便中水的百分比计算如下
粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×%。3.小肠运动试验经过14天的处理，所有的小鼠都禁食12h，但允许自由饮水。每组小鼠给予10%木炭(20mL/kg)，30min后，迅速取出小肠，测量小肠总长度(从幽门到回盲部的距离)和木炭行进的距离。木炭推进率按木炭推进距离/小肠总长度×%计算。4.血样和组织采集在实验期结束时，30min后小鼠通过腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉，并置于温度调节台上。收集血样并以rpm/min离心10min取血清。立即切开结肠，用4℃盐溶液冲洗，然后分成两部分。一部分在石蜡切片中以10%的比例固定，用于后续的组织学分析和免疫组织化学(IHC)分析，而另一部分在分析前储存在-80℃下。5.组织学分析结肠用4%甲醛固定，用水冲洗24h，用梯度乙醇(30%，50%，80%，95%，95%，%和%)脱水。然后，将其蜡包埋，切成5μm厚的薄片，并在60℃下烘烤以备后用。再通过二甲苯脱蜡、梯度酒精水合、苏木精和曙红染色、上升梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性胶密封等操作，制备结肠组织的病理切片。在光学显微镜下(倍)观察小鼠结肠的病理变化。6.MTL、GT、SST、SP、NO和Ach的评估使用市售试剂盒，通过酶联免疫吸附法(ELISA)估计血清中MTL、GT、SST和SP的浓度。而一氧化氮和乙酰胆碱的水平是根据制造商的说明使用诊断试剂盒测定的。7.免疫组织化学分析石蜡包埋的结肠组织切成5μm厚的切片。经二甲苯脱蜡后，组织用梯度乙醇脱水并浸泡在3%H2O2中以去除内源性过氧化物酶，并进行抗原修复15min。10个组织用一抗(1
在4孵育过夜，室温下加入第二抗体和链霉亲和素-过氧化物酶一起孵育30min分钟。在光学显微镜(倍)下观察切片。使用MoticImagesAdvanced3.2图像分析软件确定光密度值。8.蛋白质印迹分析结肠组织样品被均匀化，并在SDS-PAGE样品缓冲液中裂解。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。然后，将蛋白质煮沸并以10rpm/min离心15min，之后收集上清液。每个样品中等量的蛋白在10%SDS-PAGE上分离，转移到PVDF膜上，与5%牛血清白蛋白孵育1h。PVDF膜用P2X2、C-kit和SCF进行检测，抗体在4°C过夜。接下来，PVDF膜需清洗并与辣根过氧化物酶连接的二次抗体孵育。用ImageJ软件定量蛋白带密度的变化。9.统计分析测试结果用平均值表示。数据通过学生测验进行分析。统计分析采用GraphPadPrism7.0软件。P0.05被认为具有统计学意义。
结果RESULT
1.YTC对地芬诺酯致便秘小鼠大便重量和水分含量的影响
与对照组相比，模型组的粪便重量和6h内的总含水量显著降低(P0.01)。但经YTC处理后，L-YTC组和H-YTC组的粪便重量和含水量显著增加(P0.05)(图1)。
图1.YTC改善了地芬诺酯诱导的便秘小鼠的大便次数和水分含量。分析(a)6小时内的粪便数量和(b)6小时内的粪便含水量，##P0.01与对照组相比，*P0.05与模型组相比，每组n=10。
2.YTC对地芬诺酯诱导的便秘小鼠首次黑便排出时间和肠转运率的影响数据显示，与对照组相比，模型组便秘小鼠首次黑便排出时间显著延长，肠道转运率显著降低(P0.01)。然而，第一次黑便排出时间显著缩短，肠道转运率显著升高(P0.05或P0.01)(图2)。图2.YTC缩短了首次黑便的排出时间，提高了地芬诺酯诱导的便秘小鼠的碳推进率。(a)小鼠灌胃给碳，记录第一次黑色粪便的排便时间。(b)小鼠灌胃给碳，30min后处死。取出小肠，计算碳的推进率。##P0.01与对照组相比，*P0.05或**P0.01与模型组相比，每组n=10。3.结肠的组织学变化
通过苏木精-伊红染色，研究了YTC治疗后地芬诺酯诱导的便秘小鼠结肠的组织学变化。如图3所示，与对照组相比，单独用地芬诺酯处理的小鼠表现出结肠上皮的显著损失和杯状细胞的减少。用YTC治疗后，与模型组相比，发现上皮细胞被中度破坏。YTC组小鼠的结肠显示完整的上皮细胞和杯状细胞，与对照组相当。
图3.YTC减轻了地芬诺酯诱导的便秘小鼠的组织病理学变化。小鼠的代表性苏木精-伊红染色图像,×,每组n=4.(a)对照组；(b)模型组；(c)L-YTC；(d)H-YTC。
4.血清参数
为了评价YTC对便秘小鼠血清生化成分的影响，用酶联免疫吸附试验和诊断试剂盒检测了血清中与胃肠代谢物有关的几种成分的变化。如图4所示，与对照组相比，模型组的MTL、SP和Ach水平显著降低(P0.01)(图4(a)、4(d)和4(e))，而GT、SST和NO水平显著升高(P0.01)(图4(b)、4(c)和4(f))。然而，与模型组相比，YTC治疗后各指标均有逆转趋势(P0.05或P0.01)。因此，这些结果表明，YTC治疗可能调节与胃肠运动相关的因素，以减轻地芬诺酯诱导的小鼠便秘。
图4.YTC调节地芬诺酯诱导的便秘小鼠的肠激素和神经递质。用诊断试剂盒测定血清中(a)MTL、(b)GT、(c)SST、(d)SP、(e)Ach和(f)NO的含量。##P0.01与对照组相比，*P0.05或**P0.01与模型组相比，每组n=10。5.YTC对地芬诺酯诱导的便秘小鼠体内AQP3和AQP8表达的影响AQP3和AQP8在调节结肠水分转移中起重要作用。因此，我们设计检测YTC对地芬诺酯诱导的便秘小鼠结肠中AQP3和AQP8表达的影响。IHC检测结肠组织中AQP3和AQP8的表达水平，并计算OD的定量分析。如图5所示，与对照组相比，地芬诺酯提高了AQP3和AQP8的表达水平(P0.01)，而YTC降低了它们的表达水平(P0.01)。结果表明，YTC降低了地芬诺酯所致便秘小鼠结肠AQP3和AQP8的表达。图5.YTC降低了AQP3和AQP8在结肠中的表达。(a)免疫组织化学检测结肠中AQP3蛋白的表达;(b)计算AQP3的定量分析;(c)免疫组化法检测结肠中AQP8的蛋白表达;(d)计算AQP8的定量分析。6.YTC对地芬诺酯所致便秘小鼠P2X2、SCF、C-Kit表达的影响P2X2是近年来研究的受体，属于ATP门控离子通道受体，肠神经系统运动神经元和感觉神经元中P2X2受体的存在表明，它可能在胃肠运动和胃肠感觉的生理功能中起重要作用。ICCs主要分布在胃肠道，其主要功能是调节胃肠道节律性运动，产生慢波，进行电活动，参与神经传递信号转导。C-kit被认为是ICC的标志，其受体SCF与其结合。在本研究中，为了研究YTC对P2X2和ICC的影响，通过蛋白质印迹分析测定了P2X2、C-kit和SCF在结肠中的蛋白表达水平。灰度分析的定量值显示，YTC处理降低了P2X2的表达水平，而C-kit和SCF增加(P0.05或P0.01)(图6)。因此，这些结果表明便秘可能与小鼠结肠中P2X2、C-kit和SCF的表达有关。图6.蛋白质印迹检测结肠中P2X2、干细胞因子和C-kit的蛋白表达。(a)P2X2,SCF和C-kit具有代表性蛋白质印记条带;(b)P2X2;(c)SCF;(d)c-kit的半定量分析。##P0.01与对照组相比,?P0.05或?P0.01与模型组相比，每组n=3。
结论
我们的研究发现，YTC可以减轻小鼠便秘。其机制可能与其调节肠激素和神经递质的含量有关。同时，YTC通过SCF/C-kit信号通路增加ICC数量，改善结肠慢波产生，调节平滑肌收缩节律。虽然这项研究的结果提供了证据，证明YTC对药物经济学治疗模型有通便作用，但我们不能排除其他可能性。这项研究为进一步研究其化学成分以开发新药更好地控制疾病和阐明其他潜在机制奠定了基础。
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